Gentamycyna a nerki – mechanizmy toksyczności i możliwości ochrony

Jakie mechanizmy leżą u podstaw nefrotoksyczności gentamycyny?

Clopidogrel jako potencjalny lek nefroprotekcyjny w toksyczności wywołanej gentamycyną

Gentamycyna, powszechnie stosowany antybiotyk z grupy aminoglikozydów, mimo swojej skuteczności w zwalczaniu ciężkich infekcji bakteryjnych, stanowi istotne zagrożenie dla funkcji nerek. Nefrotoksyczność wywołana gentamycyną jest poważnym problemem klinicznym, prowadzącym do ostrej niewydolności nerek (ARF). Chociaż toksyczność ta zazwyczaj wykazuje zależność od dawki, różne czynniki mogą zwiększać ryzyko jej wystąpienia, w tym zwiększone dawkowanie, przedłużone stosowanie, wcześniejsze schorzenia nerek, zaawansowany wiek oraz jednoczesne stosowanie innych leków nefrotoksycznych.

Patofizjologia nefrotoksyczności wywołanej gentamycyną obejmuje złożony proces wpływający na nerki na poziomie komórkowym i molekularnym. Antybiotyk gromadzi się w komórkach kanalików nerkowych, zakłócając funkcje komórkowe i upośledzając zdolność nerek do filtrowania produktów odpadowych oraz utrzymania równowagi elektrolitowej. Gentamycyna inicjuje produkcję wolnych rodników i dysfunkcję mitochondrialną, co prowadzi do uszkodzenia komórek i apoptozy. Dodatkowo, zaburza delikatną równowagę jonów i mechanizmów transportowych w nerkach, wpływając na ich ogólną funkcję.

Coraz więcej badań wskazuje na udział układu krzepnięcia w patogenezie uszkodzenia nerek wywołanego gentamycyną. “Aktywacja kaskady krzepnięcia prowadząca do mikronaczyniowych zdarzeń zakrzepowych w nerkach może powodować uszkodzenie śródbłonka w naczyniach nerkowych i przyczyniać się do uszkodzenia tkanki nerkowej” – piszą autorzy badania. Formowanie małych skrzepów w mikrokrążeniu nerkowym może upośledzać przepływ krwi, przyczyniając się do uszkodzenia tkanek i zaburzenia funkcji nerek. Ponadto, szlaki zapalne aktywowane przez uszkodzenie wywołane gentamycyną mogą prowadzić do jednoczesnej aktywacji szlaków krzepnięcia. To wzajemne oddziaływanie między stanem zapalnym a krzepnięciem może dodatkowo nasilać uszkodzenie nerek.

Czy clopidogrel może zminimalizować toksyczne działanie gentamycyny?

Clopidogrel, lek przeciwpłytkowy, działa głównie poprzez hamowanie agregacji płytek krwi, zmniejszając ryzyko powstawania zakrzepów i zapobiegając zdarzeniom sercowo-naczyniowym, takim jak zawały serca i udary. Jednak niektóre badania sugerują, że lek ten może mieć dodatkowe działanie wpływające na stres oksydacyjny i procesy śmierci komórkowej. Liczne badania przedkliniczne wskazują, że clopidogrel może zmniejszać peroksydację lipidów, obniżając poziom malonodialdehydu (MDA), który jest uznanym markerem szkodliwych skutków stresu oksydacyjnego.

Badania wykazały również ochronne działanie clopidogrelu na nerki przed uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym w modelach mysich, szczególnie w zapobieganiu apoptotycznej śmierci komórek nerkowych. Ten efekt ochronny clopidogrelu jest związany z jego wiązaniem z receptorem purynergicznym P2Y12 wiążącym adenozynodwufosforan (ADP) na płytkach krwi.

P2Y12 to receptor sprzężony z białkiem G, który jest głównie wyrażany na powierzchni płytek krwi, gdzie jego aktywacja inicjuje agregację płytek. Nadmierna aktywacja płytek krwi została powiązana z patogenezą zawału mięśnia sercowego i udaru. Najnowsze badania rozszerzyły zakres ekspresji P2Y12, wykazując jego obecność w różnych typach komórek, w tym komórkach odpornościowych, takich jak monocyty, komórki mikrogleju, osteoblasty i osteoklasty, makrofagi związane z guzami (TAM), a także makrofagi wątrobowe w kontekście marskości wątroby i raka wątrobowokomórkowego.

Dodatkowo, wykazano, że ekspresja receptora P2Y2 (P2Y2R) jest zwiększona w chorobie wielotorbielowatej nerek, gdzie odgrywa rolę w promowaniu tworzenia i wzrostu torbieli. Wykazano, że zahamowanie ekspresji P2Y2R zmniejsza wzrost torbieli i poprawia funkcję nerek. Aktywacja P2Y2R w tych komórkach jest związana z różnorodnymi aktywnościami komórkowymi, takimi jak uwalnianie cytokin, produkcja reaktywnych form tlenu (ROS), indukcja apoptozy, wydzielanie chlorków, proliferacja komórek i zmiany w strukturze naczyń.

Jak zrealizowano badanie na modelu zwierzęcym?

Hamowanie działania receptora P2Y12 przez clopidogrel prowadzi do tłumienia agregacji i aktywacji płytek krwi oraz hamowania wytwarzania wolnych rodników. W związku z tym, niniejsze badanie miało na celu ocenę, w jaki sposób clopidogrel może oferować ochronę przed nefrotoksycznością wywołaną gentamycyną, podkreślając znaczenie przeciwdziałania aktywacji kaskady krzepnięcia w celu złagodzenia nefrotoksyczności wywołanej gentamycyną.

W badaniu wykorzystano dorosłe samce szczurów albinosów, podzielone na cztery grupy po 8 szczurów każda. Grupa kontrolna otrzymywała tylko nośnik (sól fizjologiczną w 1% v/v tween 80). Grupa z nefrotoksycznością wywołaną gentamycyną otrzymywała 100 mg/kg/dzień/i.p. gentamycyny przez 8 kolejnych dni. Grupy trzecia i czwarta otrzymywały gentamycynę oraz clopidogrel w dawkach odpowiednio 10 mg/kg/dzień i 20 mg/kg/dzień, podawany doustnie przez 7 dni przed podaniem gentamycyny i kontynuowany przez cały czas trwania eksperymentu.

Po zakończeniu eksperymentu, każdy szczur był umieszczony indywidualnie w klatkach metabolicznych na 24 godziny w celu zebrania moczu. Próbki moczu były wykorzystywane do oceny klirensu kreatyniny (Cr Cl) i aktywności enzymatycznej gamma-glutamylotransferazy (GGT). Krew pobierano z zatoki oczodołowej pod lekkim znieczuleniem eterowym. Część krwi pobierano do probówek z cytrynianem, następnie wirowano, a otrzymany supernatant wykorzystywano do oceny czasu protrombinowego (PT), stężenia (PC) i czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji (aPTT).

Inną część krwi zbierano do probówek z EDTA w celu oznaczenia różnicowania białych krwinek (WBC) i liczby płytek krwi. Trzecią część pobierano do probówek bez heparyny i wirowano przy 3000 obr./min przez 15 minut w celu oddzielenia surowicy. Surowicę przechowywano w temperaturze -20°C do późniejszej analizy stężenia kreatyniny w surowicy, cystatyny C i BUN.

Po przeprowadzeniu procedur eksperymentalnych, wszystkie zwierzęta poddano eutanazji przez inhalację dwutlenkiem węgla. Nerki zostały starannie odkapsułkowane, delikatnie przepłukane solą fizjologiczną i zważone. Prawą nerkę natychmiast rozcięto, zanurzono w roztworze Davidsona i zatopiono w blokach parafinowych do późniejszych badań histologicznych i immunofluorescencyjnych. Jednocześnie lewą nerkę poddano homogenizacji i wirowaniu, a otrzymany supernatant wykorzystano do oceny nerkowego GSH i MDA, a także produkcji NOx.

Jakie ścieżki molekularne decydują o ochronie nerek?

Wyniki badania wykazały, że szczury, którym podawano gentamycynę, wykazywały oznaki toksyczności nerkowej, co potwierdzał wzrost względnej masy nerek, podwyższone poziomy kreatyniny w surowicy, azotu mocznikowego we krwi (BUN), cystatyny C i aktywności gamma-glutamylotransferazy (GGT) w moczu oraz zmniejszenie klirensu kreatyniny. Ponadto zaobserwowano wyraźne zmiany histologiczne w nerkach, w tym martwicę nabłonka wyściełającego nerki, poważne zmiany degeneracyjne i martwicę sąsiednich kłębuszków. Dodatkowo stwierdzono rozległe nacieki leukocytarne w obszarach śródmiąższowych.

Z kolei clopidogrel wykazał znaczącą poprawę funkcji nerek, co manifestowało się znacznym zmniejszeniem poziomu kreatyniny w surowicy, BUN, cystatyny C i poziomu GGT w moczu, wraz z poprawą klirensu kreatyniny. Poprawy te były dodatkowo poparte pozytywnymi zmianami obserwowanymi w badaniu histologicznym.

Liczne badania potwierdziły, że gentamycyna podnosi markery stresu oksydacyjnego, jednocześnie obniżając markery antyoksydantów, dostarczając dowodów, że stres oksydacyjny przyczynia się do toksyczności nerkowej wywołanej gentamycyną. Gentamycyna gromadzi się w proksymalnych kanalikach krętych nerek, prowadząc do degeneracji błon rąbka szczoteczkowego, generowania wolnych rodników, redukcji obrony antyoksydacyjnej i wynikających z tego objawów, takich jak przekrwienie kłębuszków, ostra martwica kanalików i ostatecznie niewydolność nerek.

Reaktywne formy tlenu (ROS) są niezwykle reaktywnymi cząsteczkami, które wywierają znaczący wpływ na lipidy błonowe, kwasy nukleinowe i białka wewnątrzkomórkowe, powodując zmiany w ich funkcjach i strukturach oraz prowadząc do uszkodzenia komórek. MDA, produkt peroksydacji lipidów, jest znany z zakłócania aktywności enzymów, zwiększania przepuszczalności błon komórkowych, zakłócania równowagi jonów wewnątrzkomórkowych poprzez wpływ na wymianę jonów przez błonę oraz indukowania pęknięć i modyfikacji w strukturze DNA.

W obecnym badaniu zaobserwowano, że gentamycyna znacząco podnosiła poziomy IL-1β i IL-6, jednocześnie obniżając ekspresję przeciwzapalnej cytokiny IL-10 w tkance nerkowej leczonych szczurów. Wyniki te sugerują, że cytokiny zapalne mogą być kluczowymi czynnikami w progresji dysfunkcji kanalików proksymalnych i nefrotoksyczności wywołanej gentamycyną. “Nasze wyniki potwierdziły obserwacje Samarghandiana i współpracowników (2015), którzy wykazali, że wstrzyknięcie szczurom gentamycyny (100 mg/kg/dzień) przez 8 dni powodowało wyraźny wzrost ekspresji IL-6 i IL-1B, a także redukcję ekspresji przeciwzapalnych cytokin IL-10 w tkance nerkowej” – piszą badacze.

Udokumentowano, że stres oksydacyjny może aktywować różne cytokiny prozapalne poprzez aktywację czynnika jądrowego kappa B (NFκB). NF-kB reguluje różne odpowiedzi komórkowe, w tym wrodzoną odporność, stan zapalny i apoptozę. Jego ekspresja jest widoczna w upośledzeniu czynności nerek i reakcjach zapalnych. Stąd indukcja NF-kB wywołana przez ROS mogłaby potencjalnie przyczyniać się do nefrotoksyczności wywołanej gentamycyną.

W tym badaniu odnotowano znaczący wzrost poziomów NF-kB w tkance nerkowej szczurów leczonych gentamycyną. Wyniki te są zgodne z badaniem Nadeema i współpracowników (2023), w którym wykazano, że podawanie gentamycyny przez 10 kolejnych dni prowadziło do znacznego wzrostu poziomów NF-kB w tkance nerkowej szczurów leczonych gentamycyną.

“Jednym z kluczowych odkryć tego badania jest przeciwzapalne działanie clopidogrelu przeciwko nefrotoksyczności wywołanej gentamycyną” – zaznaczają badacze. Zaobserwowano, że clopidogrel prowadził do znacznego zmniejszenia ekspresji cytokin prozapalnych, IL-1β i IL-6, wraz ze zwiększeniem ekspresji IL-10 w tkance nerkowej. Wyniki te zostały potwierdzone przez inne wcześniejsze badania, w których zgłaszano silne przeciwzapalne działanie clopidogrelu. Godnym uwagi odkryciem w tym badaniu było obserwowane zmniejszenie ekspresji NF-kB w tkance nerkowej szczurów otrzymujących gentamycynę po leczeniu clopidogrelem. Wyniki te są zgodne z badaniem Jia i współpracowników (2019), którzy opisali, że clopidogrel łagodzi dysfunkcję komórek śródbłonka żylnego wywołaną przez LPS poprzez hamowanie szlaku sygnałowego NF-kB.

Odpowiedź zapalna spowodowana nadprodukcją ROS nie ograniczała się do zwiększonego uwalniania cytokin, ale wpływała również na komórki krwi i powodowała wzrost liczby białych krwinek krwi, zwany leukocytozą. “Niezwykle istotnym odkryciem w naszym badaniu jest wyraźny wzrost liczby białych krwinek i redukcja liczby płytek krwi obserwowana u szczurów leczonych gentamycyną” – podkreślają autorzy. Wyniki te są niezgodne z wcześniejszymi badaniami, które potwierdziły znaczącą zmianę liczby białych krwinek i płytek krwi, które pojawiły się po podaniu gentamycyny. Natomiast wstępne leczenie zwierząt clopidogrelem powodowało wyraźną redukcję białych krwinek i normalizację liczby płytek krwi.

Leukocyty, komórki zapalne, dostarczają cennych informacji na temat wykrywania chorób zapalnych i charakterystyki stanu zapalnego pod względem jego ciężkości i typu. Ponadto, nowe badania sugerują, że płytki krwi są zaangażowane w stan zapalny, infekcję, odpowiedź gospodarza i raka.

Płytki krwi ekspresjonują cząsteczki adhezyjne i wydzielają je, aby ułatwić ich gromadzenie się w uszkodzonych miejscach. Cząsteczki te promują adhezję płytek krwi do leukocytów i granulocytów. Dodatkowo, płytki krwi uwalniają chemotaktyczne modulatory immunologiczne, które przyciągają neutrofile, monocyty i limfocyty. Ta interakcja prowadzi do tworzenia agregatów płytek krwi-granulocytów lub płytek krwi-leukocytów, wzmacniając stan zapalny. W ten sposób płytki krwi stały się istotnymi regulatorami stanu zapalnego w różnych chorobach.

Ponadto, trombocytopenia może wskazywać na stan zapalny, ponieważ płytki krwi są rekrutowane do miejsc zapalnych i przylegają do białych krwinek, zwiększając ich aktywność i tworząc agregaty. W konsekwencji liczba krążących płytek krwi zmniejsza się. Po rekrutacji z krwiobiegu do miejsc uszkodzenia śródbłonka i stanu zapalnego, płytki krwi były tradycyjnie postrzegane jako komórki stacjonarne. Przylegają ściśle i agregują przy ścianie naczynia, generując siły adhezyjne, które aktywują fibrynogen. Ta aktywacja następnie wyzwala odkładanie fibryny i tworzenie skrzepów fibrynowych. Te konsekwencje prowadzą do tworzenia zakrzepów i przerywają przepływ krwi, który dostarcza składniki odżywcze i tlen do komórek, ostatecznie prowadząc do śmierci komórkowej.

Wyniki badania wykazały, że wstępne leczenie szczurów clopidogrelem przed podaniem gentamycyny powodowało znaczne zmniejszenie fibrynogenu i odkładania fibryny w porównaniu ze szczurami leczonymi gentamycyną.

Obecne badanie ujawniło również znaczenie apoptozy w uszkodzeniu nerek wywołanym gentamycyną. Podanie gentamycyny prowadziło do znacznego wzrostu ekspresji zarówno kaspazy-3, jak i proapoptotycznego BAX, wraz z wyraźnym spadkiem ekspresji antyapoptotycznego Bcl-2, co sugeruje aktywację szlaku apoptotycznego w uszkodzeniu nerek wywołanym gentamycyną. Wcześniejsze badania udokumentowały porównywalne wyniki. Natomiast clopidogrel wykazał działanie nefroprotekcyjne poprzez osłabienie nadekspresji kaspazy-3 i BAX przy jednoczesnym zwiększeniu ekspresji Bcl-2. Wyniki te są zgodne z różnymi eksperymentami badawczymi podkreślającymi antyapoptotyczną aktywność clopidogrelu.

Wyniki badania wskazują, że aktywacja stresu oksydacyjnego i szlaków sygnałowych apoptozy, a także proces aktywacji układu krzepnięcia, są kluczowymi czynnikami przyczyniającymi się do rozwoju nefrotoksyczności wywołanej gentamycyną. Co więcej, clopidogrel wykazał silne działanie ochronne na nefrony przeciwko nefrotoksyczności wywołanej gentamycyną, co przypisuje się jego właściwościom przeciwzakrzepowym, przeciwutleniającym, przeciwzapalnym i antyapoptotycznym.

Badanie to otwiera nowe perspektywy dla potencjalnego zastosowania clopidogrelu jako środka nefroprotekcyjnego u pacjentów leczonych gentamycyną. Wskazuje również na potrzebę dalszych badań klinicznych w celu potwierdzenia tych obiecujących wyników przedklinicznych. Lekarze powinni być świadomi złożonych mechanizmów nefrotoksyczności gentamycyny i rozważyć strategie ochronne, takie jak potencjalne zastosowanie clopidogrelu, szczególnie u pacjentów z wysokim ryzykiem uszkodzenia nerek.

Podsumowanie

Badanie koncentruje się na mechanizmach nefrotoksyczności gentamycyny i potencjalnej roli ochronnej clopidogrelu. Gentamycyna gromadzi się w komórkach kanalików nerkowych, powodując produkcję wolnych rodników, dysfunkcję mitochondrialną i aktywację układu krzepnięcia, co prowadzi do uszkodzenia nerek. Clopidogrel wykazał znaczące działanie nefroprotekcyjne poprzez hamowanie agregacji płytek krwi, redukcję stresu oksydacyjnego i procesów zapalnych. W badaniach na szczurach lek zmniejszał poziomy markerów uszkodzenia nerek, obniżał ekspresję cytokin prozapalnych i hamował szlaki apoptotyczne. Wykazano także normalizację parametrów krzepnięcia i redukcję odkładania się fibryny. Wyniki sugerują potencjalne zastosowanie clopidogrelu jako środka ochronnego u pacjentów leczonych gentamycyną, szczególnie w grupach wysokiego ryzyka uszkodzenia nerek.

Bibliografia

Akila Asmaa A., Gad Rania A., Ewees Mohamed Gamal El-Din, Abdul-Hamid Manal and Abdel-Reheim Eman S.. Clopidogrel protects against gentamicin-induced nephrotoxicity through targeting oxidative stress, apoptosis, and coagulation pathways. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology 2024, 398(3), 2609-2625. DOI: https://doi.org/10.1007/s00210-024-03380-5.