Genotyp CYP2C19 a skuteczność clopidogrelu – nowe spojrzenie przez pryzmat mikroRNA

Czy genotyp CYP2C19 wpływa na skuteczność clopidogrelu?

Clopidogrel, szeroko stosowany lek przeciwpłytkowy, jest prodrukiem wymagającym aktywacji przez enzymy wątrobowe cytochromu P450, głównie izoenzym CYP2C19. Skuteczność tego leku może być znacząco ograniczona przez polimorfizmy genetyczne CYP2C19, szczególnie warianty alleliczne *2 i *3, które prowadzą do utraty funkcji enzymatycznej. Z kolei wariant *17 zwiększa aktywność enzymatyczną, co może podnosić ryzyko krwawień. Pacjenci z genotypem słabego metabolizera (*2/*2) mogą być narażeni na zwiększone ryzyko nawracających zdarzeń niedokrwiennych z powodu niedostatecznego hamowania aktywności płytek krwi. W przypadku pacjentów po udarze niedokrwiennym, który stanowi jedną z głównych przyczyn chorobowości i śmiertelności na świecie, standardowym postępowaniem jest wdrożenie wtórnej profilaktyki przeciwpłytkowej. Jeśli występuje nietolerancja kwasu acetylosalicylowego, najczęściej stosowanym alternatywnym inhibitorem receptora P2Y₁₂ jest właśnie clopidogrel. W ostatnich latach uwaga badaczy skupiła się na roli mikroRNA (miRNA) – krótkich niekodujących cząsteczek RNA – w regulacji funkcji płytek krwi.

Jak badamy ekspresję miRNA i genotyp pacjentów?

Wykazano, że liczne miRNA, takie jak miR-126-3p, miR-19a-3p, miR-19b-3p, miR-22-3p czy miR-185-5p, regulują ekspresję receptorów płytkowych, szlaki sygnałowe oraz agregację płytek. Ich ekspresja może być modyfikowana przez czynniki genetyczne, co potencjalnie stanowi dodatkową warstwę regulacji odpowiedzi na terapię przeciwzakrzepową. Dotychczas związek między polimorfizmami CYP2C19 a ekspresją miRNA płytek nie został dostatecznie zbadany w kontekście udaru niedokrwiennego. W przeprowadzonym badaniu oceniono ekspresję wybranych miRNA płytkowych u pacjentów z udarem niedokrwiennym, leczonych clopidogrelem, w zależności od ich statusu genotypowego CYP2C19 (*1/*1, *1/*2, *2/*2). Do badania włączono 70 pacjentów, u których zastosowano clopidogrel w dawce 75 mg dziennie w ramach profilaktyki wtórnej. U każdego pacjenta przeprowadzono genotypowanie polimorfizmów CYP2C19 oraz analizę ekspresji wybranych miRNA płytkowych. Ze względu na restrykcyjne kryteria jakości, z analizy wykluczono próbki wykazujące hemolizę (definiowaną jako ΔCq (miR-23a – miR-451a) > 7), a ostatecznie analizę ekspresji miRNA w zależności od genotypu przeprowadzono u 59 osób.

Wśród badanych 70 pacjentów zidentyfikowano 6 słabych metabolizerów z genotypem *2/*2 (8,6%), 9 metabolizerów pośrednich z genotypem *1/*2 (12,9%), a pozostali posiadali genotyp dzikiego typu *1/*1 lub inne warianty genotypowe. Allele CYP2C19*2 (rs4244285) i CYP2C19*3 (rs4986893) oznaczono metodą PCR w czasie rzeczywistym z analizą krzywej topnienia, wykorzystując fluorescencyjne sondy hybrydyzacyjne (HybProbe i SimpleProbe, TIB MOLBIOL, Roche). DNA genomowe izolowano z krwi antykoagulowanej EDTA przy użyciu metody opartej na kulkach magnetycznych (MagCore® HF16, RBC Bioscience). Amplifikację PCR i analizę krzywej topnienia przeprowadzono na urządzeniu LightCycler® Cobas z480 zgodnie z protokołami producenta (LightMix® kit CYP2C19*2, *3).

Ekspresję wybranych miRNA płytkowych (hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-22-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-185-5p) oznaczono za pomocą metody RT-qPCR z dwustronnie starterowaną odwrotną transkrypcją (BioVendor). Całkowite RNA izolowano z osocza ubogopłytkowego przy użyciu zestawu miRCURY RNA isolation kit (Qiagen). Efektywność izolacji RNA monitorowano za pomocą syntetycznych kontroli spike-in, a jakość RNA weryfikowano w systemie Fragment Analyzer (Agilent). Odwrotną transkrypcję i PCR ilościowy przeprowadzono na systemie CFX384 real-time PCR (Bio-Rad). W celu zapewnienia wiarygodnych wyników, podczas izolacji RNA zastosowano dodatkowe środki kontroli jakości. Do każdej próbki przed izolacją dodawano syntetyczne kontrole spike-in (np. cel-miR-39-3p) w celu monitorowania efektywności i spójności procesu. Ponadto integralność i czystość izolowanego RNA oceniano przy użyciu systemu Fragment Analyzer. Próbki wykazujące oznaki degradacji lub zanieczyszczenia zostały wykluczone z dalszej analizy.

Analizę statystyczną przeprowadzono w programie R (wersja 4.3.3; R Core Team, 2024). Względne poziomy ekspresji miRNA obliczono za pomocą metody porównawczej 2^−ΔΔCq (wykorzystując grupę genotypową *1/*1 jako referencję). Do porównań grupowych zastosowano test Kruskala-Wallisa dla danych nieparametrycznych. Ponadto do oceny związku między genotypem (normalnie rozważanymi allelami 0, 1 lub 2 *2) a ekspresją miRNA zastosowano jednowymiarową regresję liniową (model: miRNA ~ genotyp). Przed zastosowaniem tych testów zweryfikowano podstawowe założenia (normalność rozkładu i jednorodność wariancji). Wartość p < 0,05 uznano za statystycznie istotną. Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną Szpitala Vitkovice (Ostrawa, Czechy) pod numerem referencyjnym EK35/2019 i zostało przeprowadzone zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej. Wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę przed przystąpieniem do badania.

Jakie różnice wykazano między grupami genotypowymi pacjentów?

Wśród 70 pacjentów, 26 (37%) miało genotyp *1/*1 (normalni metabolizerzy). Heterozygotyczny genotyp niosący jeden allel utraty funkcji (*1/*2 lub *1/*3) zaobserwowano u 16 pacjentów (~23%), a dwa allele utraty funkcji (np. *2/*2, *2/*3) znaleziono u 17 pacjentów (~24%). Z tych ostatnich, konkretnie 6 pacjentów (8,6%) było homozygotami *2/*2. Allel *17, który może zwiększać aktywność enzymatyczną, sklasyfikowano według przewidywanego fenotypu metabolizera. Analiza pięciu docelowych miRNA w trzech grupach genotypowych ujawniła pewne trendy. Choć żadna z różnic nie osiągnęła istotności statystycznej, u pacjentów z genotypem *2/*2 zaobserwowano tendencję do wyższej względnej ekspresji miR-126-3p i miR-185-5p w porównaniu z genotypem dzikim *1/*1. Konkretnie, grupa *2/*2 wykazała około 1,7-krotnie wyższą ekspresję miR-126-3p (średnia 1,72 ± 0,29 vs 1,00 ± 0,18 w *1/*1; p=0,12) oraz 1,5-krotnie wyższą ekspresję miR-185-5p (1,51 ± 0,24 vs 1,00 ± 0,15; p=0,15). Dla miR-19a-3p, miR-19b-3p i miR-22-3p nie zaobserwowano istotnych różnic między grupami genotypowymi (wszystkie p > 0,4).

Dodatkowo, analiza regresji liniowej wykazała nieistotną odwrotną korelację między przewidywaną aktywnością enzymatyczną CYP2C19 a poziomami miR-126-3p. Dla każdego 10% zmniejszenia aktywności enzymatycznej, ekspresja miR-126-3p wzrastała o szacowane 4,2% (współczynnik regresji β = 0,42; p = 0,08). Podobnie, ekspresja miR-185-5p wykazywała tendencję wzrostową wraz ze zwiększającą się liczbą alleli *2 (tj. niższym statusem metabolizera), choć nie osiągnęła istotności statystycznej. Z kolei miR-19b-3p wykazał niewielką i nieistotną tendencję negatywną przy większej liczbie alleli *2 (β = −0,07; p = 0,45), a miR-22-3p wykazał stabilną ekspresję we wszystkich genotypach (brak zmiany zależnej od genotypu).

Badacze przeanalizowali również, czy podstawowe parametry kliniczne i laboratoryjne różniły się w zależności od fenotypu metabolizera clopidogrelu. Pacjentów sklasyfikowano jako normalnych lub słabych metabolizerów zgodnie z ich genotypem CYP2C19. Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic w żadnej z badanych zmiennych klinicznych między grupami metabolizerów. W szczególności, wiek, wskaźnik masy ciała (BMI), profil lipidowy (cholesterol całkowity, HDL, LDL), morfologia krwi (hemoglobina, liczba leukocytów, liczba płytek itp.), białko C-reaktywne (CRP) oraz poziomy glukozy we krwi były porównywalne między normalnymi i słabymi metabolizerami (p > 0,05 dla wszystkich porównań).

Ze względu na małą liczbę pacjentów z genotypem *2/*2, moc statystyczna badania do wykrycia 1,5-krotnej różnicy w ekspresji miRNA była ograniczona. Moc post hoc oszacowano na zaledwie 38% (dla α = 0,05). Analiza post hoc wielkości próby wykazała, że do osiągnięcia istotności statystycznej zaobserwowanych różnic w ekspresji potrzebnych byłoby około 42 pacjentów w grupie *2/*2, co podkreśla potrzebę większej kohorty w celu potwierdzenia tych trendów. W przyszłych badaniach korzystne byłoby uwzględnienie frakcji niedojrzałych płytek (IPF) lub innych markerów tworzenia płytek, ponieważ mogą one korelować z funkcją miR-126-3p i dostarczyć dalszych informacji na temat obrotu płytek. Wcześniejsze badania analizowały ekspresję miRNA w funkcji płytek i odpowiedzi na clopidogrel, wykazując trendy podobne do naszych ustaleń. Dane te dodatkowo potwierdzają hipotezę, że miR-126-3p i miR-185-5p mogą służyć jako potencjalne biomarkery oporności na clopidogrel, choć konieczne są większe badania w celu potwierdzenia tej zależności. Ograniczeniem badania jest brak oceny przestrzegania zaleceń terapeutycznych, co mogłoby wpłynąć na interpretację odpowiedzi na clopidogrel. Należy to uwzględnić w przyszłych badaniach.

Czy miRNA mogą stać się biomarkerami oporności na clopidogrel?

MiR-126-3p odgrywa kluczową rolę w regulacji integralności naczyń i angiogenezie. Ten miRNA bezpośrednio wpływa na funkcję płytek poprzez modulację ekspresji receptorów ADAM9 i P2Y₁₂, które są ważnymi cząsteczkami dla aktywacji i agregacji płytek. Obniżona ekspresja miR-126-3p była związana ze zwiększoną reaktywnością płytek, podczas gdy zwiększona ekspresja może przyczyniać się do hamowania agregacji płytek. MiR-185-5p reguluje głównie szlak sygnałowy PI3K/Akt, który jest kluczowy dla aktywacji płytek i odpowiedzi na różne agonisty. Zwiększona ekspresja miR-185-5p może hamować sygnalizację PI3K/Akt, a tym samym zmniejszać reaktywność płytek. Podwyższenie regulacji tych miRNA w grupie z genetycznie zmniejszoną aktywacją clopidogrelu (*2/*2) może odzwierciedlać mechanizm kompensacyjny lub alternatywny szlak adaptacyjny przeciwdziałający zmniejszonemu hamowaniu P2Y₁₂. Innymi słowy, płytkowe miRNA, takie jak miR-126-3p i miR-185-5p, mogą wzrastać u słabych metabolizerów jako epigenetyczna odpowiedź na utrzymanie hamowania płytek. Jednak ta hipoteza wymaga dalszych badań, ponieważ nasze badanie nie miało wystarczającej mocy, aby statystycznie potwierdzić różnice.

Natomiast pozostałe analizowane miRNA (miR-19a-3p, miR-19b-3p, miR-22-3p) nie wykazały zmian ekspresji zależnych od genotypu. Ta stabilna ekspresja we wszystkich genotypach CYP2C19 sugeruje, że te konkretne miRNA nie są dotknięte wariantami metabolicznymi CYP2C19. Na przykład, miR-19b-3p wykazał niewielką tendencję spadkową u nosicieli alleli *2, ale nie była ona istotna i jest zgodna z doniesieniami w literaturze, które nie wiążą miR-19b-3p z funkcją płytek. Podobnie, ekspresja miR-22-3p pozostała spójna niezależnie od genotypu, sugerując, że jej regulacja jest prawdopodobnie niezależna od szlaków związanych z CYP2C19. Co ważne, stwierdzono, że charakterystyka kliniczna i laboratoryjna była porównywalna między normalnymi i słabymi metabolizerami. Nie zaobserwowano istotnych różnic w wieku, markerach zapalnych, morfologii krwi ani innych czynnikach współistniejących między grupami. Potwierdza to, że zaobserwowane wzorce ekspresji miRNA są przede wszystkim związane z genotypem, a nie z zewnętrznymi zmiennymi fenotypowymi lub klinicznymi. Innymi słowy, tendencja do wyższego miR-126-3p i miR-185-5p u słabych metabolizerów jest prawdopodobnie bezpośrednią konsekwencją genetycznego wpływu na metabolizm clopidogrelu, a nie efektem zakłócającym wyjściowego stanu klinicznego lub chorób współistniejących.

Badanie to ma kilka ograniczeń, które należy wymienić. Najważniejszym ograniczeniem jest mała liczba pacjentów ze słabym metabolizmem; tylko 6 osób z genotypem *2/*2 zostało włączonych (moc post hoc ~38% dla α = 0,05), co znacznie ogranicza moc statystyczną. Innym ograniczeniem jest pomiar ekspresji miRNA w osoczu, a nie w izolowanych płytkach. Poziomy miRNA w osoczu mogą nie odzwierciedlać dokładnie wewnątrzkomórkowej zawartości miRNA w płytkach i mogą być zakłócone przez kontaminację przez inne komórki lub egzosomy. Zalecamy, aby przyszłe badania uwzględniały większą liczbę pacjentów, szczególnie tych z genotypem *2/*2, w celu potwierdzenia zaobserwowanych trendów i osiągnięcia niezbędnej mocy statystycznej. Przyszłe badania powinny również rozważyć analizę ekspresji miRNA w izolowanych płytkach; takie podejście może dostarczyć dokładniejszych informacji dotyczących wewnątrzkomórkowych poziomów miRNA i poprawić interpretację wyników. Idealnie, należy przeprowadzić analizę wielowymiarową, która uwzględnia możliwe czynniki zakłócające, aby dalej izolować wpływ genotypu na ekspresję miRNA od innych zmiennych wpływających. Ponadto zalecamy rozszerzenie dyskusji poprzez włączenie najnowszej literatury na temat regulacji funkcji płytek przez miRNA i omówienie potencjalnych implikacji klinicznych tych ustaleń, szczególnie w kontekście spersonalizowanej terapii przeciwpłytkowej.

Podsumowując, to pilotażowe badanie ujawniło tendencję do wyższej ekspresji miR-126-3p i miR-185-5p u pacjentów z genotypem CYP2C19 *2/*2 leczonych clopidogrelem. Wyniki te sugerują możliwą epigenetyczną regulację odpowiedzi na terapię przeciwpłytkową, podczas gdy inne badane miRNA (miR-19a-3p, miR-19b-3p, miR-22-3p) wydają się być niezależne od genotypu w swojej ekspresji. Wdrożenie tych zaleceń mogłoby znacznie poprawić przyszłe badania i pomóc zwalidować trendy zidentyfikowane w tym pilotażowym badaniu, przyczyniając się tym samym do cennych spostrzeżeń w dziedzinach farmakogenetyki i neurofarmakologii. Odkrycia te mogą mieć istotne implikacje dla personalizacji terapii przeciwpłytkowej u pacjentów po udarze niedokrwiennym, szczególnie tych z genotypem związanym ze słabym metabolizmem clopidogrelu.

Podsumowanie

Przeprowadzone badanie analizowało wpływ genotypu CYP2C19 na skuteczność clopidogrelu oraz ekspresję mikroRNA u pacjentów po udarze niedokrwiennym. W grupie 70 pacjentów zidentyfikowano różne warianty genetyczne, w tym 8,6% słabych metabolizerów z genotypem *2/*2. Badanie wykazało tendencję do wyższej ekspresji miR-126-3p i miR-185-5p u pacjentów z genotypem *2/*2, choć różnice nie osiągnęły istotności statystycznej. Pozostałe badane miRNA (miR-19a-3p, miR-19b-3p, miR-22-3p) nie wykazały istotnych różnic w ekspresji między grupami genotypowymi. Wyniki sugerują możliwą epigenetyczną regulację odpowiedzi na terapię przeciwpłytkową, co może mieć znaczenie dla personalizacji leczenia. Głównym ograniczeniem badania była mała liczba pacjentów ze słabym metabolizmem, co wpłynęło na moc statystyczną wyników.